Osvita.ua Высшее образование Рефераты Биология Копіювання ДНК або полімеразна ланцюгова реакція. Реферат
Загрузка...

Копіювання ДНК або полімеразна ланцюгова реакція. Реферат

Полімеразна ланцюгова реакція. Ампліфікація РНК. Аналіз ПЛР-ампліфікованої ДНК. Підготовка ПЛР-продуктів. Гель-електрофорез

Уперше склад інгредієнтів, що входять у реакційну суміш для постановки полімеразної ланцюгової реакції, і основні принципи використання праймерів (коротких штучно синтезованих молекул ДНК) для одержання копій ДНК були описані Kleppe із співавт. у 1971 році. Однак тоді ще не була продемонстрована основна риса ПЛР - експонентне збільшення кількості копій фрагмента вихідної ДНК як результат реакції.

Це було здійснено в 1985 р. на фірмі Cetus. Наступне використання в ПЛР термостабільної ДНК-полімерази  істотно розширило можливості її застосування, як у наукових цілях, так і в клініці.

У 1985 році Saiki із співавт. опублікували статті, у якій була описана ампліфікація геномної послідовності b-глобіна. З цього моменту кількість публікацій, у яких автори повідомляли про застосування ПЛР у своїх роботах, стало збільшуватися в геометричній прогресії. Метод став настільки популярний, що сьогодні уже важко представити роботу в області молекулярної біології без його використання.

Особливо бурхливий розвиток метод полімеразної ланцюгової реакції одержав завдяки міжнародній програмі "Геном людини". Були створені сучасні лазерні технології секвенування (розшифровки нуклеотидних послідовностей ДНК). Якщо в недавнім минулому для розшифровки послідовності ДНК розміром у 250 пару нуклеотидів (п. н.) був потрібна тиждень, то сучасні лазерні секвенатори дозволяють визначати до 5000 п. н. у день. Це у свою чергу сприяє значному росту інформаційних баз даних, що містять послідовності ДНК.

В даний час запропоновані всілякі модифікації ПЛР, показана можливість створення тест-систем для виявлення мікроорганізмів, виявлення крапкових мутацій, описані десятки різних застосувань методу. Ми коротенько розглянемо теоретичні основи ПЛР і застосування цього методу для молекулярно-генетичного дослідження зразків тканин. Основна увага буде приділено практичним аспектам, важливим для аналізу звичайних тканинних зразків.

Полімеразна ланцюгова реакція

ПЛР - це здійснювана in vitro специфічна ампліфікація нуклеїнових кислот, ініційована синтетичними оліго-нуклеотидними праймерами; основні її етапи представлені на мал. 2. ПЛР-цикл складається з теплової денатурації ДНК, її отжога з праймером і подовження ланцюга (елонгації); зміна цих етапів відбувається в результаті простої зміни температури.

Праймери при цьому орієнтуються на матриці так, що число раундів реплікації росте експоненціально, відповідно збільшується і число копій специфічної нуклеотидної послідовності.

Застосування молекулярних методів для цілей клінічної діагностики обмежується їхньою невисокою чутливістю і тривалістю аналізу. Так, для виявлення нуклеїнової кислоти-мішені методом гібридизації in situ із застосуванням радіоактивно  міченого зонда необхідно, щоб мішень була присутня в препараті в декількох тисячах копій. Нерідке число аномальних послідовностей у клінічному препараті діагностично-значимо, але менше цієї величини і гібридизація може дати помилко негативний результат.

На відміну від цього ПЛР дозволяє виявити унікальну нуклеотидну послідовність. Для цього в реакційну суміш додають у великому надлишку специфічні для даної послідовності олігонуклеотидні праймери ("амплімери"), що утворюють з нею комплекс, і проводять реплікацію ДНК in vitro. Оскільки амплімери гібридизуються з обома ланцюгами ДНК, то і нативна послідовність, і синтезовані ПЛР-продукти можуть служити матрицями в наступних раундах реплікації, у результаті чого число копій унікальної послідовності експоненціально збільшується.

Завдяки цьому послідовності, що є присутнім у клінічному препараті в мінімальній кількості (одна чи кілька копій) і не піддаються виявленню ніякими іншими методами, легко виявляються за допомогою ПЛР. ПЛР дозволяє знайти всього одну аномальну послідовність на 100000-1000000 нормальних кліток.

Експонентне збільшення числа копій молекули-мішені не тільки забезпечує високу чутливість методу, але і полегшує їхнє виявлення. Кожен раунд ПЛР займає від 2 до 5 хв., і звичайно для досягнення необхідної чутливості досить 25-50 раундів, тобто 2-4 год. Таким чином, весь аналіз можна провести протягом одного дня. Крім того, оскільки зміст ПЛР-продуктів досить великий, можна використовувати неізотопні методи детекції.

У табл. 1 приведені дані, що дозволяють порівняти метод ПЛР з іншими молекулярно-генетичними методами дослідження. Видно, що він володіє двома важливими перевагами: високою чутливістю і нетривалістю аналізу.

Таблиця 1. Порівняння різних методів гібридизації

 

ПЛР

Блот-гібридизація по Саузерну

Гібридизація in situ

Чутливість

1/100000

1/100

10 мішеней

Специфічність

Висока

Висока

Висока

Тривалість аналізу

1 доба

1 доба

1 доба

 

Ампліфікація РНК

Можливість використання РНК як мішень для ПЛР істотно розширює спектр застосування цього методу. Наприклад, геноми багатьох вірусів (гепатит З, вірус інфлюенци, пікорнавіруси і т. д.) представлені саме РНК. При цьому в їхніх життєвих циклах відсутня проміжна фаза перетворення в ДНК. Для детекції РНК необхідно в першу чергу перевести її у форму ДНК.

Для цього використовують обернену транскриптазу, що виділяють із двох різних вірусів: avian myeloblastosis virus і Moloney murine leukemia virus. Використання цих ферментів зв'язано з деякими труднощами. Насамперед, вони термолабільні і тому можуть бути використані при температурі не вище 42°С, тому що при такій температурі молекули РНК легко утворять вторинні структури, то ефективність реакції помітно знижується і за різними оцінками приблизно дорівнює 5%.

Починаються спроби обійти цей недолік використовуючи в якості оберненої транскриптази термостабільну полімеразу, отриману з термофільного мікроорганізму Thermus Thermophilus, що виявляє транскриптазну активність у присутності Mn2+. Це єдиний відомий фермент, здатний виявляти як полімеразну, так і транскриптазну активність.

Для проведення реакції оберненої транскрипції в реакційній суміші також як і в ПЛР повинні бути присутнім праймери як запал і суміш 4-х дНТФ, як будівельний матеріал.

Після проведення реакції оберненої транскрипції, отримані молекули кДНК можуть служити мішенню для проведення ПЛР.

Аналіз ПЛР-ампліфікованої ДНК

Для аналізу ПЛР-ампліфікованої ДНК використовують різні методи. Ми розглянемо три найбільш простих: гель-електрофорез, дот-блот-гібридизацію і блот-гібридизацію по Саузерну. З їхньою допомогою можна аналізувати більшість ПЛР-продуктів, але абсолютно точні результати можна одержати тільки секвенуванням.

Підготовка ПЛР-продуктів

Насамперед необхідно видалити мінеральну олію, що покривала реакційну суміш. Для цього в пробірку для ПЛР додають краплю хлороформу, пробірку струшують і центрифугують при 12 000 g протягом 1 хв, щоб відокремити водяну фазу, що містить ПЛР-продукти. Ампліфіковану; ДНК можна зберігати з хлороформом при 4°С протягом декількох тижнів. Для наступного аналізу звичайно беруть від 1/10 до 1/5 обсягу реакційної суміші.

При використанні ДНК виділення з кліток крові підготовчі роботи не проводяться.

Гель-електрофорез

Електрофорез в агарозном гелі дозволяє легко, без застосування радіоізотопів, знайти ампліфіковану ДНК і визначити її розмір. Зупинимося на деяких її особливостях стосовно аналізу ПЛР-ампліфікованої ДНК. 10-20 мкл ампліфікованої ДНК розділяють у 2% агарозном гелі з додаванням спеціального барвника ДНК, наприклад, бромистого етидія разом зі стандартними фрагментами розміром 50-1000 п. н.

При заливанні за допомогою гребінок у гелі формують спеціальні лунки, у які надалі вносять продукти ампліфікації. При використанні ДНК виділеної з клітин крові використовують 5 мкл ампліфікованої ДНК змішують з 3 мкл барвники на парафилме і наносять у лунку.

Пластину гелю поміщають в апарат для горизонтального гель-електрофорезу і підключають джерело постійної напруги. Негативно заряджена ДНК починає рухатися в гелі від мінуса до плюса. При цьому більш короткі молекули ДНК рухаються швидше, ніж довгі. На швидкість руху ДНК у гелі впливає концентрація агарози, напруженість електричного поля, температура, склад електрофорезного буфера і, у меншому ступені, ГЦ-склад ДНК.

Усі молекули одного розміру рухаються з однаковою швидкістю. Барвник вбудовується (інтеркалірує) площинними групами в молекули ДНК. Після закінчення електрофорезу, що продовжується від 10 хв. до 1 години, гель поміщають на фільтр трансіллюмінатора, що випромінює світло в ультрафіолетовому діапазоні (254 - 310 нм). Енергія ультрафіолету, що поглинається ДНК в області 260 нм, передається на барвник, змушуючи його флуоресценувати в оранжево-червоній області видимого спектра (590 нм).

Яскравість смуг продуктів ампліфікації може бути різною. Тому часто в ПЛР-лабораторіях прийнято оцінювати результат по трьох- чотирьох чи п'ятибальній системі. Однак, як уже відзначалося раніше, це не можна зв'язувати з початковою кількістю Днк-мішені в зразку. Часте зменшення яскравості світіння смуг зв'язано зі зниженням ефективності ампліфікації під впливом інгібіторів або інших факторів.

Електрофорез проводять при високій напрузі (10-15 В/див), оскільки утворювані при ПЛР невеликі фрагменти складно детектувати після електрофорезу протягом ночі при невеликій напрузі внаслідок їхньої інтенсивної дифузії. Розділення можна підвищити, використовуючи поліакриламідні або агарозні гелі NuSieve (FMC Bio-Products, Rockland, USA) з високою концентрацією агарози (3-4%). Утім, якщо аналіз потрібно провести швидко і при невеликих витратах, цілком прийнятні 2% агарозні гелі.

Звичайно при ампліфікації ДНК, виділеної з фіксованих тканин, вихід ПЛР-продуктів нижчий і вони менш специфічні, чим у випадку ампліфікації високо-очищеної ДНК.

Інструкція 1 по приготуванню агарозного гелю (50мол).

Агарозний гель складається з 1,8% агарози і 98,2% Трис-буфера.

Зважуємо агарозу (0, 9г).

Переносимо агарозу в термостійку колбу.

Додаємо  50мол трис-буфера в колбу.

Установлюємо плашку, установлюємо гребінку на плашку.

Плавимо агорозу шляхом нагрівання в мікрохвильовій печі до одержання однорідного розчину.

Додаємо барвник етидіум бромід у колбу і перемішуємо.

Заливаємо агарозний гель  на плашку.

Гібридизація ПЛР-ампліфікованої ДНК по Саузерну

Цей метод дозволяє ідентифікувати смуги в гелі, що спостерігаються після електрофорезу ампліфікованої ДНК. Для гібридизації використовуються як ізотопно, так і неізотопно мічені зонди. Докладно метод гібридизації ПЛР-продуктів описаний у протоколі 1.

Протокол 1. Гібридизація ПЛР-ампліфікованої ДНК по Саузерну

Матеріали:

  • Буфер для денатурації: 1,5 М NaOH, 0,5 М NaCl
  • Буфер для нейтралізації: 1,5 М трис-Нс1, 0,5 М NaCl, p 6,5
  • 20 х SSPE: 3,6 М NaCl, 0,2 М фосфат натрію, 0,02 М ЄДТА, рН 7,4
  • 10% (в/о) ДСН

Методика:

  • Для денатурації фрагментів ДНК гель вимочують у буфері для денатурації при обережному погойдуванні протягом 30 хв. при кімнатній температурі, потім витримують у буфері для нейтралізації протягом 30 хв.
  • За цей час вимочують нейлоновий фільтр для переносу ДНК у 6 х SSPE протягом 5хв. (або довше). Ми використовуємо фільтри Genetrans 45 (Fiasco, Wolburn, Massachusetts, USA).
  • Збирають систему для переносу ДНК, і проводять перенос при кімнатній температурі протягом ночі. Як буфер для переносу використовують 20 х SSPE.
  • По закінченні переносу знімають фільтрувальний папір і відзначають положення лунок на фільтрі. Фільтр знімають і для видалення прилиплої агарози промивають у 20 х SSPE протягом 1 хв.
  • Пришивають ДНК до фільтра, помістивши останній (стороною з ДНК нагору) на 5 хв. під УФ-лампу (254 нм). Можна скористатися і спеціальним приладом для пришивання ДНК (Stratagene, La Jolla, California, USA).
  • Поміщають фільтр у поліетиленовий пакет і запаюють його. Проводять перед-гібридизацію при 42 0С протягом 10 хв. і гібридизацію з відповідним міченим зондом при тій же температурі протягом 30-60 хв. Як зонд звичайно використовують 5-мічені за допомогою полінуклеотидкінази олігонуклеотиди.
  • Промивають фільтр у двох-трьох змінах 2 х SSPE, 0,1% ДСН, по 5 хв. у кожній зміні. Іноді на цьому етапі проводять відмивання й у більш жорстких умовах, але необхідність цієї процедури визначають експериментальним шляхом.
  • Гібридизований зонд виявляють за допомогою радіоавтографії або неізотопними методами детекції.

Дот-блот-гібридизація ПЛР-ампліфікованої ДНК

Дот-блот-гібридизація дає просту відповідь по типу так-ні й особливо корисна в тих випадках, коли проводиться аналіз великого числа зразків. Один із прикладів застосування цього методу описаний у протоколі 2.

Протокол 2. Дот-блот-гібридизація ПЛР-ампліфікованої ДНК

Матеріали:

  • Розчин для денатурації: 0,4 М NaOH, 1 мм ЭДТА.
  • 20 х SSPE (див. протокол 15.7).
  • Нейлоновий фільтр.
  • Прилад для одержання дот-блотів.

Методика:

  • Вимочують нейлоновий фільтр у дистильованій воді не менш 5 хв.
  • 2.10-20 мкл ПЛР-ампліфікованої ДНК додають до 300 мкл. розчину для денатурації (денатурація при цьому відбувається практично миттєво).
  • Кожен зразок вносять в окремий осередок приладу для одержання дот-блотів; стежать за тим, щоб для усмоктування зразка з осередку було потрібно близько 1 хв.
  • Промивають кожен осередок 20 х SSPE три рази по 5 хв.
  • Виймають фільтр із приладу й обполіскують його в 20 х SSPE.
  • Виконують операції, описані в протоколі 15.7, починаючи з п. 5.

Інтерпретація результатів

Результат ПЛР можна кваліфікувати як позитивний чи негативний у залежності від того, виявлена в зразку інтересуюча нас мішень чи ні. Однак порушення нормального ходу ампліфікації, недостатня чутливість методу і непередбачений поліморфізм послідовності-мішені в області зв'язування праймерів чи гібридизаційного зонда може дати помилково негативний результат.

У випадку забруднення зразків і випадкової гомології між зондом, праймерами і послідовністю, подібною з мішенню, виходять помилково негативні результати. Проблеми, що виникають у зв'язку з перехресними реакціями за участю зонда або праймерів і можливим поліморфізмом.

Вибір контролів

Дуже важливим для правильної інтерпретації результатів є вибір контролів. Позитивні і негативні контролі повинні бути добре охарактеризовані. Часто використовують ДНК із клітинних ліній, що завідомо містять чи не містять послідовність-мішень.

У кожнім аналізі потрібні як мінімум три контролі:

  • позитивний контроль;
  • негативний контроль;
  • бланк-контроль.

Бланк-контроль - це реакційна суміш, у якій присутні усі компоненти, за винятком ДНК; він є індикатором забруднень. Один тип позитивного контролю повинний містити максимальне число послідовностей-мішеней, інший - невелике їхнє число. Це дозволяє визначити чутливість і ефективність ПЛР.

У деяких випадках ампліфікація взагалі не відбувається, і якщо є підстави думати, що отриманий результат помилково негативний, дуже важко визначити, по якій саме причині.

Щоб вирішити цю проблему, кожен зразок необхідно тестувати, провівши ампліфікацію якої-небудь геномної послідовності, наприклад гена рецептора ліпопротеїнів низької щільності або р-глобінового гена. При цьому розмір геномної послідовності-мішені повинний бути небагато більший, ніж досліджуваний; це дозволить переконатися, що ДНК зразка не занадто сильно деградована. При ПЛР будь-якого зразка тканин людини геномна ДНК повинна ампліфікуватися.

Відсутність ампліфікації може означати інгібування ферменту, сильну деградацію ДНК чи те, що її занадто мало. У цьому випадку треба повторити ампліфікацію зразка, збільшивши і зменшивши кількість ДНК-матриці або збільшивши концентрацію ДНК-полімерази Tag. Ампліфікація може  бути відсутня незважаючи на всі прикладені зусилля. Це може бути зв'язане із сильним некрозом досліджуваної тканини або фіксацією препарату не в 10% формаліні, а в інших фіксаторах. У цьому випадку єдиним виходом є повторна біопсія.

Геномні праймери можна використовувати в одному раунді ПЛР разом із праймерами, специфічними у відношенні послідовності-мішені: ампліфікація двох послідовностей йде при цьому одночасно. Такий множинний ПЛР-тест може бути менш чуттєвим, чим той, у якому використовується один набір праймерів, але він виключає появу помилково негативного результату.

Чутливість

Визначити чутливість ПЛР-методу стосовно аналізу фіксованих і залитих у парафін препаратів досить складно. Це зв'язано з відсутністю добре охарактеризованих катаних тканин з відомим змістом послідовності-мішені, а чутливість методу при аналізі очищеної ДНК і ДНК, отриманої з фіксованих формаліном тканин, за таких самих умовах помітно розрізняється.

Однак у даний час існує можливість створювати штучні фіксовані тканини з відомим змістом послідовності-мішені на основі добре охарактеризованих клітинних ліній. Для цього змішують клітки, що містять потрібну послідовність і не містять її, суміш фіксують у формаліні і заливають у парафін.

Отриманий блок нарізають і обробляють так само, як біоптати тканин, проводять ПЛР і визначають чутливість методу. І хоча цей метод не дозволяє визначити чутливість ПЛР-методу з такою високою точністю, як цього хотілося б, він вказує напрямок до правильної інтерпретації результатів.

Суміш кліток Raji (приблизно 50 копій ДНК EBV на клітку) і Molt 3 (не містять EBV) збирали центрифугування, фіксували в 10% забуференному формаліні протягом 1 год. і заливали в парафінові блоки. Робили зрізи товщиною 10 мкм, що містять приблизно по 1000 кліток, обробляли їх, і проводили ПЛР-аналіз з використанням геномних і EBV-специфічних праймерів. Продукти ампліфікації аналізували за допомогою дот-блот-гібридизації з геномним і EBV-специфічним зондами.

Як і треба було очікувати, гібридизація з геномним зондом відбувалася у всіх клітинних сумішах, а з EBV-специфічним спостерігалася тільки в суміші, у якій частка кліток лінії Raji складала 0,01, але не 0,001 або 0,0001. Таким чином, при тих умовах, у яких проводилася ПЛР, вдається виявити приблизно 10 EBV-інфікованих клітин на 1000 нормальних (число клітин, з яким проводився ПЛР-аналіз). Підвищити чутливість можна, змінивши умови проведення ПЛР або використовуючи для аналізу більшу кількість клітин.

Кількісний ПЛР-аналіз

Логічно думати, що кількість утворюваних при ПЛР ДНК корелюється з числом послідовностей-мішеней в аналізованому зразку. Однак так буває не завжди. Часто такі виключення спостерігаються при роботі з препаратами тканин, залитими в парафін: у цьому випадку число факторів, що впливають на ефективність ампліфікації, особливо велике. Це може бути природа тканини, спосіб фіксації і її тривалість, час, що пройшов від моменту одержання тканини до її фіксації, "вік" парафінових блоків, розмір зрізу, кількість виділеної і використаної для ПЛР ДНК.

Часто клінічні зразки отримують в умовах, далеких від оптимальних, що теж утрудняє проведення кількісного аналізу, особливе визначення абсолютної кількості послідовності-мішені. Для таких препаратів розроблений простий відносний метод, заснований на ПЛР-аналізі декількох розведень препарату ДНК. Для цього готують послідовні десятикратні розведенням ДНК у воді і проводять ампліфікацію в умовах, що дозволяють одержати максимальну чутливість; число циклів ПЛР при цьому може досягати 50.

Такий аналіз дозволяє оцінити мінімальне число послідовностей-мішеней у препараті, оскільки при досить сильному розведенні ампліфікація повинна припинитися. Якщо паралельно проводити ампліфікацію якої-небудь геномної послідовності, то можна визначити співвідношення між числом клітин і числом послідовностей-мішенів. При відомому числі клітин у препараті (наприклад, у препараті СМЖ) інтерпретацію результатів проводять так, як це описано в табл. 2.

Таблиця 2. Визначення чутливості методом розведення

Число ампліфікованих кліток

Послідовність-мішень

Геномна послідовність

Інтерпретація

100000

+

+

1 мішень/100000 кліток

10000

+

+

1 мішень/ 10000 кліток

1000

+

+

1 мішень/ 1000 кліток

100

+

+

1 мішень/ 100 кліток

10

+

+

1 мішень/10 кліток

1

+

+

Мішень практично

у кожній клітці

0

-

-

Система працює нормально

 

Точна кількість кліток в останніх розведеннях визначити неможливо внаслідок  помилок у піпетуванні і пуассонівському розподілу числа клітин. Геномні послідовності повинні ампліфікуватися і детектуватися на рівні приблизно 1 клітини. У цьому випадку, якщо послідовність-мішень міститься в 1% клітин, останнє розведення, що дає позитивний сигнал, повинне відповідати 100 клітинам.

В даний час ПЛР-тести можна ставити тільки в спеціально оснащених клінічних лабораторіях. Зразки тканин, одержувані при звичайних хірургічних операціях, фіксують формаліном і заливають у парафін. Такі препарати можна досліджувати методом ПЛР, що при необхідності дозволяє провести молекулярно-генетичний аналіз без заморожування і збереження препаратів.


28.12.2011

Чтобы получать первым
все новости от «Osvita.ua»
в Facebook — нажмите «Нравится»

Освіта.ua

Спасибо,
не показывайте мне это!